200kd的大蛋白western blot的實驗

A1：首先使用6-8%的分離膠，其次電轉時間适當延長，250mA，90分鍾左右。如果同時需要跑一些分子量小的蛋白，最好将大小兩種膜分開轉膜

A2：注意以下問題：1、 緩沖液中加甲醇的作用是使SDS遊離出來，并增加膜結合蛋白的量，但過多的甲醇會使膠收縮，造成大分子在凝膠中的沉澱而降低轉膜效率。大分子量的蛋白質（如大于60kDa）應使用低濃度的甲醇或不使用甲醇。

2、 電轉移效果檢查方法：①考馬斯亮蘭染色電轉移後的凝膠，檢查是否還有蛋白質存留；②麗春紅染色，檢查膜是否吸附了蛋白質。

3、 濕式電轉方法效率高，半幹式電轉方法轉移速度較快。

4、 阻斷劑有BSA、Tween-20、脫脂奶粉和其他動物的血清等多種，阻斷的效果不盡相同，如果實驗中發現背景過高，可以嘗試更換阻斷劑。

5、 一抗和酶标二抗的濃度十分重要，濃度過高，造成背景過高；濃度過低造成靈敏度偏低，實驗中應根據一抗和酶标二抗的效價，對此參數進行優化。此外，一抗的質量十分關鍵，抗體特異性和效價直接影響實驗結果。

6、 須嚴格控制假陽性反應，可使用免疫前血清作爲陰性對照，同時要以抗原作爲絕對的陽性對照，準确确定陽性條帶的位置。

A3：6%左右的膠，電泳的話得試一下，80V，先跑半小時，然後100V跑半小時，0.45mm 的PVDF膜，轉膜普通轉膜液350MA，90分鍾左右